| 品牌 | 弦華生物 | 產地類別 | 國產 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 綜合 |
弦華生物3S 無縫克隆試劑盒
貨號:EV0070
英文名稱:3S Seamless Cloning Kit
產品規格:10T50T100T
【產品介紹】
無縫克隆技術（seamless cloning）作為一種高效、靈活的分子克隆方法，相較于傳統克隆技術具有顯著優勢。無縫克隆技術通過簡化操作流程、提高靈活性和效率，成為現代分子生物學中替代傳統酶切連接操作的主流方法。其核心優勢在于突破酶切位點限制、正確率及廣泛適用性，從而為涉及基因操作的基因表達、蛋白純化、基因編輯、合成生物學等領域提供了一種高效的研究工具。
本產品是一種即用型的無縫克隆產品。通過同源重組的方法，可以將目的DNA片段按照預定方向、快速、高效和精準地插入到線性化載體中，并且最終構建的克隆中不會引入任何額外的堿基序列。在任何載體中，反應時間短至20分鐘，陽性率可達到 95~100%。只需插入的 DNA 片段末端與載體末端具有 15~25個同源堿基序列就可以在載體的任意位點完成克隆重組。
【注意事項】（操作前仔細閱讀）
1. 重組反應后的產物不可長時間室溫放置，推薦-20℃保存；
2. 試劑盒重組效率較高，感受態轉化效率>106 CFU/μg DNA即可，重組產物轉化體積最多不應超過所用感受態細胞體積的1/10，即可以得到較好的實驗結果；
3. 試劑盒中的含有陽性對照載體和片段，請在收到試劑盒后開始正式實驗之前進行測試。
【試劑盒組成】
組分 | 10次 | 50次 | 100次 |
2X Seamless Cloning Mix | 50μl | 250 μl | 500 μl |
DNA fragment (20 ng/μl） | 4 μl | 40 μl | 40 μl |
linearized control vector (20 ng/μl，Amp+） | 2 μl | 10 μl | 20 μl |
【標準實驗步驟】
1. 線性化載體和片段的制備
1.1 載體制備
1.1.1 線性化載體的獲得方式可以通過酶切或者反向PCR。
1.1.2 若通過酶切，請選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化。推薦盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區域進行克隆。
1.1.3 酶切時建議選用雙酶切。若選用單酶切，需延長酶切時間或增加內切酶使用量，以確保載體切開，減少原載體殘留，從而提高鑒定結果準確性和正確率。
1.1.4 推薦對酶切或PCR制備的載體進行膠回收，以提高純度。酶切處理的載體還可根據所用內切酶失活條件進行80℃ 10 min處理后直接進行重組反應，但需確保酶切。
1.2 插入片段制備
1.2.1 引物設計時，請在引物5'端加入包含酶切位點的15~25 bp堿基。引物由5'至3'分別為載體同源臂-酶切位點-基因特異性擴增序列。注：若載體通過反向PCR制備，此時插入片段的引物序列中可不含上述酶切位點。
1.2.2 目的基因的擴增推薦使用高保真聚合酶進行PCR反應。
1.2.3 插入片段的回收可采用膠回收或將反應液進行DpnI處理以消化PCR模板。
2. 重組
請在冰上配置以下反應體系，然后37℃反應15~20min
組分 | 重組反應 | 陽性對照 | 陰性對照 |
2X Seamless Cloning Mix | 5μl | 5 μl | 5 μl |
DNA fragment | X ng | 2 μl | - |
linearized vector | 25-50 ng | 1 μl | 2μl |
H2O | Up to 10 μl | 2 μl | 3μl |
2.1 重組反應的插入片段與載體的用量為1：1~1：10（質量濃度比）；
2.2 30℃延長重組反應時間至40分鐘，可提高重組效率，獲得更多克隆；
2.3 重組后的體系，若不立即轉化，可在-20℃放置至多1周。
3. 轉化
請將重組產物通過標準的化轉或電轉操作進行轉化。
弦華生物3S 無縫克隆試劑盒【存放說明】
-20oC保存，至少一年有效。可以分裝后在-80oC長期保存。
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